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三毛猫はほぼすべてメスで、オスはめったに生まれない。オスの三毛のほとんどは、性染色体の組み合わせが普通と違う例外の猫である。

猫の毛を茶にするか黒にするかを決める遺伝子はX染色体にある（2025年に九州大学などが特定）。三毛になるには茶と黒の両方、つまりX染色体が2本要るが、オスは普通XYでXが1本しかないので、茶か黒のどちらか一色になる。

オスの三毛は、X染色体が1本多いXXYのほか、2匹分の受精卵が一体化したキメラ（XX/XY）でも生まれる。英国の調査で染色体を調べたオスでは、XXYよりキメラの方が多かった。XXYのオスはふつう繁殖できないが、キメラのオスが子猫を残した例がある。どれくらい珍しいかは「3,000匹に1匹」「3万匹に1匹」などと言われるが、どちらも元の調査は見つからなかった。日本では船の守り神として珍重され、1956年に出航した第1次南極観測隊には「航海のお守りに」と託されたオスの三毛猫「たけし」が同行し、昭和基地で越冬した。ウィキペディア日本語版「三毛猫」にも仕組みとたけしの話がある。